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comment décongeler des cellules?

Objectif : Apprendre à décongeler correctement des cellules stockées à -80°C ou en azote liquide pour les remettre en culture tout en minimisant le stress cellulaire et la perte de viabilité. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Matériel nécessaire : -Cellules congelées (flacons cryogéniques) -Bain-marie à 37°C -Milieu de culture cellulaire préchauffé (par exemple, DMEM, RPMI avec sérum et antibiotiques) -Flacon de culture cellulaire (de taille appropriée, par ex. 25 cm² ou 75 cm²) -Pipettes stériles et pointes de pipette -Centrifugeuse (optionnelle, selon les besoins) -PBS (Tampon Phosphate Salin, sans Ca²⁺ ni Mg²⁺) (optionnel pour un rinçage) -Incubateur à 37°C avec 5% CO₂ -Équipement de protection individuelle (gants, blouse, etc.) ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Méthodologie : 1-Préparation du milieu de culture Assurez-vous que le milieu de culture est préchauffé à 37°C dans un bain-marie ou un incubateur. Cela garantit que les cellules seront immédiatement placées dans un environnement optimal après la décongélation. 2-Décongélation des cellules Sortez rapidement le flacon cryogénique contenant les cellules congelées de l'azote liquide ou du congélateur à -80°C. Plongez immédiatement le flacon dans un bain-marie à 37°C, en agitant doucement pour uniformiser la décongélation. Cette étape doit être rapide (environ 1 à 2 minutes) pour minimiser le temps pendant lequel les cellules sont à une température intermédiaire où elles sont vulnérables. 3-Transfert des cellules dans le milieu de culture Une fois les cellules complètement décongelées, désinfectez l'extérieur du flacon avec de l'éthanol à 70% avant de l'ouvrir sous une hotte stérile. Transférez délicatement le contenu du flacon dans un tube conique stérile contenant environ 5 à 10 mL de milieu de culture préchauffé. Cela dilue le DMSO (agent cryoprotecteur) qui pourrait être toxique pour les cellules à haute concentration. 4-Centrifugation des cellules (Optionnel) Si vous souhaitez éliminer complètement le DMSO, centrifugez le tube à environ 200-300 g pendant 5 minutes. Décantez le surnageant contenant le DMSO et resuspendez les cellules dans un milieu de culture frais et préchauffé. 5-Ensemencement des cellules Transférez les cellules décongelées dans un flacon de culture cellulaire contenant un volume adéquat de milieu de culture (par ex. 10 mL pour un flacon de 25 cm²). Placez le flacon dans l'incubateur à 37°C avec 5% CO₂. 6-Observation des cellules Après environ 24 heures, vérifiez les cellules au microscope pour vous assurer qu'elles se sont bien attachées et qu'elles commencent à proliférer. Remplacez le milieu de culture si nécessaire pour éliminer tout résidu de DMSO ou de débris. -------------------------------------------------------------------------------------- Conseils et astuces : --La décongélation doit être rapide, mais ne surchauffez pas les cellules. Le bain-marie à 37°C est idéal. --Minimisez le temps d'exposition au DMSO après décongélation, car il peut être cytotoxique. --Assurez-vous que tout le matériel utilisé est stérile pour éviter toute contamination.