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Coloração diferencial: Teste de Gram

Os microrganismos podem ser observados vivos (em suspensão aquosa) ou mortos (sob a forma de esfregaços secos, fixados e corados). Neste último caso, o processo de preparação das lâminas envolve três etapas: a. Realização do esfregaço: estender sobre uma lâmina, uma gota de suspensão microbiana obtida diretamente por meio do recolhimento mediante pipeta de Pasteur, de um meio de cultivo líquido ou emulsionando em uma gota de água estéril, previamente depositada na lâmina, o conteúdo de uma alça de platina que foi introduzida em um cultivo sobre meio sólido. Preparar o esfregaço com o auxílio de uma segunda lâmina ou lamínula. b. Fixação: uma vez seco, passar o esfregaço três a quatro vezes rapidamente no interior da parte amarela de uma chama. c. Coloração: a coloração do material a ser observado pode ser simples ou diferencial, conforme definido a seguir. A coloração simples consiste na aplicação de uma única solução corante sobre o esfregaço, produzindo uma coloração uniforme em todas as células. Como exemplo, utiliza-se o azul de metileno para observar a morfologia das células. Já a coloração diferencial evidencia diferenças entre células ou partes da célula. As células são expostas a mais de uma corante ou reagente. Na microbiologia, um dos testes de coloração diferencial mais utilizado é o Teste de Gram. A coloração consiste na aplicação de um corante básico, o cristal violeta, e uma solução de iodo e iodeto de potássio (lugol), em um esfregaço previamente fixado na chama. A preparação é, então, tratada com um solvente orgânico (álcool ou acetona), com o objetivo de descolorir as células. As células que retêm o complexo cristal violeta iodo após a lavagem com o solvente, apresentando coloração azul-violeta escura, são denominadas Gram-positivas. As células que não retêm o corante após a ação do solvente, quando tratadas com um segundo corante (fucsina ou safranina), chamado corante de contraste ou contra-corante, adquirem a coloração vermelha. São denominadas Gram-negativas. No total, são utilizadas quatro soluções no teste de Gram: 1) Gram I - Cristal violeta (Cristal violeta), que penetra no interior das células. 2) Gram II - Solução iodo-iodetada (lugol). Há a formação de um complexo cristal violeta+lugol no citoplasma. 3) Gram III - Álcool ou acetona. Ocorrem alterações diferenciadas na parede celular das bactérias Gram positivas e Gram negativas. Os lipídeos são destruídos na parede das bactérias Gram negativas e com isso o complexo cristal violeta+ lugol sai da célula, que perde a coloração. 4) Gram IV - Fucsina diluída ou safranina, que é o corante de contraste. Será absorvido apenas por bactérias Gram negativas, já que estas estão internamente insaturadas. As Gram positivas já estão preenchidas pelo complexo violeta+lugol e, portanto, não absorvem o corante de contraste em quantidade significativa.