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院士點評Nat Materials丨血栓的力學驅動機制：細胞力的黑暗面VS心血管治療的新曙光？

點評丨阮長耿（中國工程院院士） 責編丨迦漵 血小板在人體中起到多樣化的功能和作用，而其中最為人熟知的是它在血栓與止血過程中的中心地位。血小板的活化是其發揮正常止血生理功能的基礎，但血小板的異常活化會導致血栓形成，是動脈粥樣硬化等缺血性心腦血管疾病的基礎病因，嚴重影響人類健康。目前，缺血性心腦血管疾病的死亡率在中國和全球均居榜首。據權威報告預測，未來十年里伴隨著中國社會經濟的發展和國民生活方式、體質、人口年齡比例的變化，與糖尿病、肥胖症和代謝綜合症密切相關的動脈粥樣硬化性心腦血管疾病患病人數還會快速增長。抗血小板藥物是目前臨床上治療心血管疾病的主要藥物，令人焦心的是這些藥物有致出血的嚴重副作用，治療中常常陷入「療效」和「安全性」不能兩全的矛盾困境，究其原因有二：第一，血栓的形成在機理上與止血功能重疊，限制了抗血小板藥物（例如阿司匹林和P2Y12抑制劑）的可用劑量；第二，糖尿病、肥胖症和代謝綜合症等疾病所引起的血栓對傳統抗血小板藥物存在某種未知原因的耐藥性，導致藥效大打折扣【1】。 一直以來，心血管領域的研究都試圖在細胞和分子層面了解血小板的活化機理，據此為抗血栓治療提供新策略。有趣的是，很多工作已發現血小板不僅可以被特定生物活性物質（如ADP、凝血酶等）激活，而且對機械力（mechanical force）具有強敏感性——動脈狹窄等造成的高速擾流可以活化血小板，並使其快速相互聚集形成血栓【1, 2】。血小板的許多生理功能都依賴於其表面分子——整合素αIIbβ3。αIIbβ3的活化會為血小板帶來強大的聚集能力。αIIbβ3和另一種糖蛋白分子Ibα同屬於血小板感應機械力的重要受體分子。但是αIIbβ3在擾流環境下如何活化血小板，其活化血小板的機理是否與生物活性物質有別，仍然是懸而未決的問題。另一方面，糖蛋白Ibα和αIIbβ3如何在分子層面上配合實現血小板的力學激活也是未解之謎。 2019年3月25日，來自美國喬治亞理工學院的朱承教授團隊聯合澳大利亞雪梨大學Shaun Jackson團隊以長文形式在Nature Materials 上在線發表了題為An integrin αIIbβ3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation 的論文【3】。該工作由來自美國和澳大利亞五個研究所的十一位科學家使用多種世界前沿生物學、生物物理學、力學生物學技術共同完成，在納米（10-9米）量級，皮牛（10-12牛頓）量級和單分子水平上對血栓形成的力學驅動機制進行了深度闡述。 研究成果： 該研究首先結合微流技術（圖1a）、全血共聚焦動態成像和整合素構象抗體免疫螢光（圖1b），觀測血小板在區域性狹窄所造成的高速擾流環境下的表現。實驗發現，血小板確實會在區域性狹窄的下游形成血栓，而這種由機械力驅動形成的血栓，其中支持各個血小板之間聚集的主要分子機制是一種特殊活化形態（EC，Extended- close）的整合素αIIbβ3（圖2c）。在該形態下，αIIbβ3整體處於拉直的狀態，而αIIb和β3雙鏈之間並未有所分離，區別於之前觀測到的Bent-close（BC，整合素的未活化狀態）及Extended-open（EO，整合素的活化狀態）（圖1a）。這是首次在活體細胞上確認EC形態整合素的存在，並發現其生理意義。 圖1. Nature Materials長文中使用的微流系統及標誌性實驗結果。（a）微流系統裝置示意圖。（b）三種可識別αIIbβ3特定形態的抗體（MBC370.2，AP5，PAC-1）所對應的靶點和形態。（c）區域性狹窄管道在高流速下形成的血栓只能被MBC370.2識別，被AP5和PAC-1識別，表明血小板表面的αIIbβ3處於EC形態。 為了進一步了解這種特殊形態，研究人員使用雙載生物膜測力儀（dual Biomembrane Force Probe，dual BFP）對單個血小板進行檢測。生物膜測力儀（Biomembrane Force Probe，BFP）由一個被毛細管吸住的紅細胞和一個黏附在紅細胞正前方的玻璃珠組成。玻璃珠上附有與血小板表面受體蛋白對應的配體分子或抗體，由此可以與血小板產生黏附作用。實驗過程中，電腦程式會讓一根毛細管吸住一隻活血小板，反覆接觸玻璃珠並試探性地進行拉扯。因為紅細胞具有極佳的彈性，所以通過觀察紅細胞是否被拉扯變長以及拉長的程度和時長，就可以知道血小板與玻璃珠之間的黏附情況，並測量受體和配體/抗體分子之間的親和力和在不同拉力下的結合穩定性。不同於傳統生物膜測力儀只有一套測力裝置，雙載生物膜測力儀同時擁有兩套測力裝置：Probe I和Probe II（圖2a，b），因此可先用Probe I對血小板進行力學刺激，轉而用Probe II監測血小板的激活狀態。研究發現，EC形態的αIIbβ3是通過糖蛋白Ibα和其配體分子VWF-A1之間的力學信號傳導激活血小板實現，並且在功能上處於一種「輕度活化」的狀態——其與配體分子（包括纖維蛋白原和纖粘蛋白）之間的親和力（圖2c）和結合穩定性（圖2d）均處於未活化狀態（BC形態）和活化狀態（EO形態）之間。至此，本工作對這種αIIbβ3新狀態在單分子水平上進行了全面的形態和功能性刻畫（圖2e）。 圖2：雙載生物膜測力儀介紹和對單分子αIIbβ3刻畫的核心結果 研究進一步發現，αIIbβ3的這種輕度活化只能通過糖蛋白Ib的力學信號傳導實現，卻無法由化學刺激激發。在這部分研究中，實驗人員使用了三種不同的生物物理學技術——生物膜測力儀、微流流動腔、錐板式粘度計——給予血小板可精確計量的力學或化學刺激並觀察血小板表面的αIIbβ3活化狀態，以達到相互佐證的目的。三種技術的實驗結果高度吻合，一致顯示：在不同強度（或依文中所稱，「劑量」）的力學信號刺激下，糖蛋白Ib的力學信號傳導可以穩定地將αIIbβ3激活到輕度活化狀態，其中力學信號的「劑量」與輕度活化狀態αIIbβ3的數量明顯正相關。而另一方面， ADP的生物學刺激會直接將αIIbβ3激活到活化狀態，其中ADP的劑量與活化狀態αIIbβ3的數量也明顯正相關。這些結果表明，αIIbβ3受力學和生物學驅動激活所採用的信號傳遞通路互不相同。 最後，研究發現輕度活化的αIIbβ3可以通過自身的力學信號傳導完成進一步的「自我活化」，實現高粘附性——這一過程雖與之前觀測到的整合素親和力成熟（affinity maturation）現象吻合，但其獨特之處在於αIIbβ3的整個激活過程並不依賴任何外界化學刺激，而完全由兩步力學信號傳導「接力」完成，因此在文章中被新定義為「力學驅動親和力成熟」（mechanical affinity maturation）現象。研究深入探索了αIIbβ3實現自我活化的生理條件：第一，它必須以αIIbβ3達到輕度活化作為前提，否則αIIbβ3會穩定存在於未活化狀態中，無法被力學刺激激活，並且輕度活化的αIIbβ3數量會直接影響其自我活化的效率；第二，它需要外部機械力的反覆拉扯作為力學刺激，如果僅僅將纖維蛋白原或纖粘蛋白放置在血小板表面但不施加拉力，無法實現力學驅動親和力成熟，甚至輕度活化的αIIbβ3數量都會隨時間逐漸減少；第三，它需要胞外存在高濃度的鈣離子，並且實驗觀測發現力學驅動親和力成熟的過程伴隨著大量的鈣離子湧入血小板，說明鈣離子在αIIbβ3的自我活化過程中作為信號傳導媒介擔任著重要作用。 該研究為心腦血管疾病的新治療思路提供了重要理論依據。研究發現的「力學驅動親和力成熟」現象，解釋了血小板為何僅靠高流速的力學刺激就可以自我激活至高黏附性，導致血栓的形成。更重要的是，由於αIIbβ3 「力學驅動親和力成熟」的信號傳遞通路與生物學信號激活通路並不相同，所以本研究也為解釋為何諸多傳統抗血栓藥物在治療糖尿病、肥胖症和代謝綜合症所引起的動脈粥樣硬化、動脈狹窄等與高流速、複雜流場相關的心血管疾病時效果差強人意提供了一種新的思路——這些藥物雖然抑制了血小板的生物學信號激活，但可能並不能阻斷血小板受力學信號刺激的激活。為了更安全有效地對相關心血管疾病進行治療，我們需要同時對αIIbβ3 「力學驅動親和力成熟」的信號通路進行針對性抑制。 圖3. 在本工作中推廣了第二代生物膜測力儀（照片左側）的三人照片： 陳昀峰（後右一）、居理寧（後左一）、朱承（前排）。在本工作中，生物膜測力儀是研究血小板如何感應機械力刺激的主要技術手段。 本文最年輕的兩位主力研究員陳昀峰（29歲，第一作者）和居理寧（32歲，共同第一作者）本科先後畢業於北京大學工學院，博士師從美國喬治亞理工學院朱承教授（圖3，三人照片），目前分別在美國斯克里普斯研究所和澳大利亞雪梨大學心臟研究所從事相關方向的博士後研究。近年來三人通過一系列工作推廣了第二代生物膜測力儀對活細胞上的單分子力感應機理的研究。該團隊首先將生物膜測力儀與螢光顯微鏡結合，實現了在活細胞上同步獲取力譜和鈣離子信號的技術革新【4】。通過在血小板系統上使用該技術，他們率先刻畫了血小板表面的單分子糖蛋白Ib受體傳導力學信號的力學機制【5】。2017年他們進一步將系統升級為雙載生物膜測力儀，首次在單細胞上實現對上下游受體之間的信號串擾（ 「crosstalk」 ）行為在時間和空間上的分開量化[6]， 該系統在這項研究中作為主要技術手段之一充分發揮威力。2018年該團隊就使用此系統精確刻畫了糖尿病患者的血小板對機械力產生的過度敏感性，為糖尿病引發的血栓相關疾病提供了部分機理性解釋【1】(詳見BioArt2018年對該工作的報導：中國、澳、美學者合作揭示糖尿病與血栓疾病的新關聯：機械力的黑暗面）。 專家點評 阮長耿（中國工程院院士，江蘇省血液研究所所長，主要從事血小板，血栓與出凝血疾病的基礎研究與臨床診療） 血小板的異常活化是缺血性心腦血管疾病的發病基礎。因此，抗血小板活化藥物如血小板ADP受體P2Y12拮抗劑普拉格雷，替格瑞洛及血栓素A2 抑制劑阿司匹林是目前臨床上血栓性心腦血管疾病治療的常用藥物。然而，ADP及血栓素A2信號通路也是血小板發揮生理止血功能的關鍵，所以這些常用的抗血小板活化藥物都有引發致命性出血的嚴重副作用。長期以來，血栓領域的研究都試圖在細胞和分子層面了解血小板活化的機制，希望為開發療效強、出血副作用少的新型抗血栓藥物提供思路。有趣的是，以前的研究已發現血小板對機械力（mechanical force）具有強敏感性——血小板在動脈狹窄等造成的高速擾流環境下容易活化，並可以快速聚集形成血栓。近年研究發現血小板表面的糖蛋白受體GPIbα和整合素受體αIIbβ3屬於血小板感應機械力的重要分子， 但是，他們之間如何在分子層面上配合實現血小板的力學活化是未解之謎。 3月25日喬治亞理工學院的朱承教授團隊和澳洲雪梨大學