ДНК-полимераза Т7 превращается в секвеназу: фактор процессивности тиоредоксина. скачать в хорошем качестве

ДНК-полимераза Т7 превращается в секвеназу: фактор процессивности тиоредоксина.

ДНК-полимераза T7 — это двухсубъединичный белок, состоящий из полимеразного домена (ген 5 бактериофага T7, 84 кДа) и фактора процессивности (ген trxA E. coli, тиоредоксин, 12 кДа). Особенности ДНК-полимеразы T7: Она обладает сильной экзонуклеазной активностью в направлении 3'–5' одноцепочечной ДНК (в 8 раз выше) Экзонуклеазной активностью в направлении двухцепочечной ДНК Тиоредоксин сам по себе не обладает ни полимеразной, ни экзонуклеазной активностью ДНК Для полимеразной активности и экзонуклеазной активности в направлении двухцепочечной ДНК необходимо присутствие тиоредоксина, но не экзонуклеазной активности в направлении 3'–5' одноцепочечной ДНК Отсутствие тиоредоксина снижает экзонуклеазную активность в направлении двухцепочечной ДНК (в 200 раз) В активном центре ДНК-полимеразы T7 расположены два иона магния, способствующие реакции полимеризации. Один атом Mg++ располагается рядом с 3'-ОН-группой последнего добавленного нуклеотида на праймерной цепи. ДНК-полимераза Т7 и тиоредоксин связываются в комплексе «один к одному» с кажущейся константой диссоциации 5 нМ. Связывание тиоредоксина с ДНК-полимеразой Т7 увеличивает сродство полимеразы именно к праймеру-матрице, что позволяет полимеризовать тысячи нуклеотидов без диссоциации. Процессивность двухсубъединичной ДНК-полимеразы Т7 в 100 раз выше, чем у односубъединичной ДНК-полимеразы Т7. Связывание тиоредоксина с ДНК-полимеразой Т7 не оказывает никакого влияния на активность полимеразы. Процессивность описывает количество нуклеотидов, непрерывно включаемых ДНК-полимеразой с использованием одного и того же праймера-матрицы без диссоциации. Как и многие другие ДНК-полимеразы, полимераза Т7 может быть представлена ​​как открытая правая рука, состоящая из домена большого пальца, связывающегося с тиоредоксином, домена пальцев, в котором находится каталитическая активность, и домена ладони. ДНК-полимераза Т7 в секвеназе: Высокая процессивность ДНК-полимеразы Т7 с тиоредоксином (300 нуклеотидов на одно связывание) Способность включать модифицированные нуклеотиды (ddNTP), которые важны для секвенирования ДНК, наравне с обычными dNTP Но 3'-5' нуклеазная активность вредна для секвенирования ДНК Когда концентрация dNTP падает, скорость экзонуклеазной активности возрастает почти до скорости полимеразной активности, что приводит к отсутствию чистого синтеза ДНК или деградации ДНК. Связанная с этим экзонуклеазная активность также приводит к тому, что ДНК-полимераза простаивает в областях со вторичными структурами в матрице, вызывая вариабельность интенсивности. Экзонуклеазная активность фермента может воздействовать на меченые полосы ДНК при длительной инкубации. Применение: Используется при подготовке радиоактивных зондов Используется в направленном мутагенезе Амплификация больших фрагментов Синтез второй цепи кДНК Используется в секвенировании ДНК по Сэнгеру