🧪 ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК, РНК ИЛИ БЕЛКА | СПЕКТРОФОТОМЕТР И МЕТОД, ОСНОВАННЫЙ НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ скачать в хорошем качестве

🧪 ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК, РНК ИЛИ БЕЛКА | СПЕКТРОФОТОМЕТР И МЕТОД, ОСНОВАННЫЙ НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Измерение количества ДНК, РНК или белка посредством измерения поглощения света молекулами в спектрофотометре имеет ряд преимуществ. К ним относятся скорость, малый объем образца и использование внутренних свойств молекул ДНК, РНК или белка для проведения оценки. Среди этих преимуществ следует отметить отсутствие необходимости в красителях или реагентах; измерение происходит непосредственно в поглощении света биомолекулой. Бензольные кольца в молекулах ДНК/РНК и аминокислотные остатки триптофана в белках обеспечивают это характерное взаимодействие с ультрафиолетовым (УФ) светом. Недостатком прямого детектирования ДНК, РНК или белка является то, что мешающие соединения и загрязняющие вещества, такие как реагенты, используемые для подготовки биомолекулы к анализу, могут влиять на поглощение света, приводя к завышению или занижению концентрации. К распространенным загрязняющим веществам относятся соли, свободные нуклеотиды, нецелевые биомолекулы, растворители или детергенты. Стандартные показания поглощения УФ-излучения также недостаточно чувствительны для обнаружения низких концентраций аналита и не позволяют различить РНК и ДНК, количественно оценивая все нуклеиновые кислоты, присутствующие в образце. Однако вы можете дифференцировать ДНК и РНК, посмотрев на соотношение A260/A280; для РНК оно, как ожидается, будет ближе к 2,1, в то время как для двунитевой ДНК составит ~1,85–1,88. Чтобы избежать мешающих или загрязняющих соединений, можно использовать специальный краситель, который флуоресцирует при связывании с ДНК, РНК или белком. Флуоресцентные молекулы (называемые флуорофорами) при возбуждении ультрафиолетовым светом определенной длины волны способны испускать собственный свет на другой (более низкой энергии) длине волны. Использование таких реагентов позволяет избежать мешающих или загрязняющих соединений при измерении концентрации. Реагенты можно приобрести в виде набора для проведения флуоресцентных измерений ДНК, РНК или белка с помощью такого прибора, как Qubit. Для этого разведите флуоресцентный краситель (в 200 раз концентрированный) до 1x с помощью разбавителя реагента. То есть добавьте 1 часть красителя к 199 частям разбавителя. Анализ рекомендуется проводить в объеме 200 мкл для каждого образца. Если у вас несколько образцов, умножьте количество образцов, которые вы хотите проанализировать, на 200 мкл. Например, если вам требуется 400 мкл для всего количества образцов, которые вы собираетесь проанализировать, добавьте 2 мкл красителя к 398 мкл разбавителя (400 мкл объема / 200-кратный объем красителя). Добавьте 2 мкл вашего образца (ДНК/РНК) к 198 мкл разбавленного красителя (при разведении образца в соотношении 1:100). При разведении исходного образца в соотношении менее 1:100 скорректируйте соотношение образца к разбавленному красителю. Разведение 1:100 подходит для набора DNA High Sensitivity, но может не подойти, например, для набора Broad Range. Встряхните пробирки (входящие в набор реагентов Qubit) со смесью красителя и образца в течение 3 секунд для перемешивания. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 2 минут перед измерением количества нуклеиновых кислот. Чтобы измерить количество флуоресцентного сигнала во флуориметре Qubit, выберите тип анализа, вставьте пробирку и закройте её перед измерением образца.