Tecnologie avanzate per la Bio-Medicina Genomica (prof.ssa Vincenza Barresi) скачать в хорошем качестве

Tecnologie avanzate per la Bio-Medicina Genomica (prof.ssa Vincenza Barresi)

Il Progetto Genoma Umano ha rappresentato un punto di svolta sostanziale per la comprensione della struttura e della complessità del genoma e per la messa a punto di tecnolo gie che permettessero l'analisi del genoma in breve tempo con pochi esperimenti. Dalla metodica di sequenziamento ideata da Frederick Sanger sono trascorsi circa 40 anni. E' una metodica enzimatica che utilizza durante la fase di allungamento del DNA, 2-deossinucleotidi e 2,3-dideossinucleotidi; l'incorporazione di questi ultimi interrompe l'allungamento della catena permettendone la sua visualizzazione in seguito a separazione elettroforetica dei frammenti ottenuti. Su proposta di Renato Dulbecco e con il coinvolgimento di istituzioni pubbliche e private, è stato condotto un progetto di sequenziamento del Genoma Umano basato sulla metodica di Sanger che ha raggiunto l'obiettivo nel 2004. Il metodo di sequenziamento di Sanger viene detto di 1° generazione e, in quest'ultimo decennio, stiamo assistendo alla crescita esponenziale di metodiche di sequenziamento di 2° e 3° generazione. Le tecnologie di sequenziamento di 2° generazione o di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) sono sensibili e permettono di ottenere contemporaneamente migliaia di sequenze diverse, in parallelo, in un solo esperimento. Esistono diverse piattaforme ma tutte sono caratterizzate da una fase di frammentazione del DNA genomico, una fase di amplificazione clonale, una fase di sequenziamento e di rivelazione, una fase di elaborazione dei risultati. Le tecnologie di 2° generazione attualmente a disposizione della comunità scientifica sono: 1) la tecnologia con amplificazione clonale a ponte (bridge) e sequenziamento tramite nucleotidi terminatori marcati con fluorocromi; 2) la tecnologia con amplificazione clonale mediante una PCR in emulsione (emulsion PCR) e sequenziamento tramite primers di interrogazione e una DNA ligasi; 3) la tecnologia con amplificazione clonale mediante una PCR in emulsione e determinazione della sequenza mediante misurazione delle variazioni di pH dovute al rilascio di protoni in seguito all'incorporazione di nucleotidi non modificati da parte della polimerasi all'interno di chip a semiconduttori. Le tecnologie di 3° generazione che stanno emergendo sono rivolte al sequenziamento di molecole frammentate con l'eliminazione della tappa di amplificazione clonale al fine di ridurre eventuali errori che possano essere introdotti durante l'amplificazione.